医学论文发表：免疫组化法测定肺动脉高压后心肌组织

admin 发表于 2012-01-12 09:52 | 来源：医学论文发表 | 阅读 47 views

摘要：
免疫组化法测定肺动脉高压后心肌组织OPN和整合素β3表达使用生物的生物素化抗体SP法，反OPN和整合素β3的鼠抗人单克隆抗体（工作液），羊抗鼠二抗（工作液）。组织蜡座3〜5毫米片。 ①60〜12常规烤盘二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水后;②新鲜30毫升/ L H2O2封闭内源性酶15分钟;蒸馏水，PBS浸泡6分钟;③组织切片置于EDTA抗原修复液（pH值= 8.0），微波加热修复12分钟;（山羊血清封闭非特异性结合位点（SP试剂盒）20分钟，4，添加抗过夜℃;⑤复温后的第二天，滴加山羊抗鼠生物素化二抗（SP试剂盒二），在室温25分钟孵育;⑥辣根过氧化物酶标记的链亲和素工作液（SP试剂盒三）添加到幻灯片，并在培养室温度为25分钟;⑦加上民建联在室温下的颜色为5〜20分钟，光学显微镜的试剂，用自来水洗净后的显色反应⑧苏木后常规逐级酒精脱水，二甲苯，中性树脂封片，显微镜和拍照。设置阳性和阴性对照，阳性对照，PBS代替一抗体作为阴性对照的主要医院的病理学家提供的部分。 OPN和整合素β3阳性细胞表现为细胞有一个棕色的颗粒质量，使用IBAS 2.5全自动图像分析系统，400倍光镜下，每张切片被送往五个不同地区的视野测试测量灰度值，平均价值获得。
西方blot检测OPN和整合素β3蛋白表达水平确定西方OPN和整合素β3蛋白表达水平的杂交。利用治疗后，常规蛋白电泳和膜内转印心肌组织。在抗体反应（1：200,4℃，12h后的二级抗体反应（1:1,1 H）），然后用过氧化物酶标记的链球菌抗生物素蛋白（1:1）1H反应。检测与响应系统，以增强免疫反应的蛋白质。与柯达胶卷的颜色反应，将设置电影ES2000扫描仪和图像扫描软件的Power Mac Photoshop6.0转移到美国国立卫生研究院图像1.62软件。使用NIH图片凝胶反应的面积和密度的宏观工具进行了测量和计算心肌OPN和整合素β3蛋白表达水平。
用来比较两组方差分析，方差齐采用LSD法，丢失方差法，使用Dunnett的T3之间的统计方法。双变量相关分析采用Pearson等级相关方法。所有数据均用SPSS l1.0软件系统进行统计分析。
结果
各组OPN和对照组整合素β3在mRNA水平和比较右心室心肌OPN和整合素β3受体的表达水平是非常低，肺高血压（PHA1 4组）各组大鼠右心室和整合的OPN因子β3的表达均显着增加，与据组比较差异有显着性意义（P均<0.O1），与长期肺动脉高压，两者之间的表达水平呈现出上升趋势。表2和图1，图2。
表2各组大鼠OPN和整合素β3mRNA的表达
OPN的mRNA /β-肌动蛋白整合的mRNA /β-肌动蛋白组
对照组，0.46 ± 0.06 0.46 ± 0.10
实验组
PHA1 0.65 ± 0.05 * 0.66 ± 0.09 *
PHA2 0.77 ± 0.06 * 0.84 ± 0.15 *
PHA3 0.84 ± 0.05 * 0.95 ± 0.09 *
PHA4 0.94 ± 0.07 * 0.98 ± 0.10 *
F值2.998 1.552
与对照组比较，* P <0.01;

C，1,2,3,4，分别为对照组，PHA1，PHA2，PHA3和PHA4组。
图1四组大鼠OPN的mRNA表达在右心室肌与右心室OPN和整合素β3mRNA表达水平的相关分析相关分析大鼠右心室肥厚指数显示，右心室心肌0PN mRNA的表达水平和右心室肥厚指数显着正相关（R = 0.828，P <0.01）。右心室心肌整合β3mRNA表达水平和右心室肥厚指数显着正相关（R = 0.822，P <0.01）。
2.3组OPN和整合素β3蛋白表达的免疫组化和OPN和整合素β3比较，主要是在心肌细胞的细胞质中表达，在光镜下呈棕黄色染色。对照组，左，右心室心肌OPN和整合素β3受体的表达水平很低。肺动脉高压组左，右心室心肌OPN和整合素β3受体表达水平增加（图2，3和4），并从长期和增加所造成的肺动脉高压。与对照组相比有显着性差异（P <0.01）。表3所示。
集团的OPN整合β3
对照组，1.36 ± 0.22 1.35 ± 0.21
实验组
PHA1 4.37 ± 0.52 * 4.32 ± 0.51 *
PHA2 6.06 ± 0.97 * 6.05 ± 0.92 *
PHA3 8.22 ± 1.21 * 8.02 ± 1.18 *
PHA4 9.84 ± 1.25 * 9.22 ± 1.21 *
与对照组比较，* P <0.01;

各组OPN和整合素β3西方blot检测蛋白表达水平，并在实验4周，大鼠OPN的PHA4右心室心肌和整合素β3蛋白水平（分别为16.67 ± 1.73和14.28 ± 1.22）相比，对照组高（分别为4.42 ± 0.72和3.93 ± 0.70），P <0.01;详细见表3，图5。
表3右心室心肌组织蛋白OPN和整合素β3的相对表达（灰度值）
组组组PHA4
OPN 4.42 ± 0.72 16.67 ± 1.73 *
整合素β33.93 ± 0.70 14.28 ± 1.22 *
与对照组比较，* P <0.01
图5 OPN和整合素β3西方印迹图（注：实验组意味着PHA4组）
讨论
3.1 OPN的心脏重建中的作用
OPN的是最近发现的其他监管物质，它是一个重要的细胞外基质蛋白的功能，因为细胞介导的连接骨与骨基质，骨基质矿化和重吸收过程中，被命名为的。陈[4]用不同的显示技术，在其他骨桥蛋白在血管平滑肌细胞（VSMC）从收缩表型合成表型的标志，因为许多学者深入研究OPN和心血管疾病之间的关系。 OPN作为一个身体反应蛋白，抗发炎和修复过程中的重要作用，逐步引起人们的注意。
在心血管系统，OPN的来源于血管内皮细胞（EC），平滑肌细胞，巨噬细胞。血管平滑肌细胞，EC和OPN的相互作用RGD依赖和Ca2 +抗素αvβ3抗体可以在一定程度上阻止了这些细胞OPN的的迁移。说明血管平滑肌细胞，EC和OPN表达交互。血管重塑的OPN发挥重要的调节作用[5]，在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的细胞因子：PDFG，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子TGF – B，IL -我，血管紧张素Ⅱ可刺激血管内皮细胞和平滑肌细胞的过度表达OPN的
[6]。原位杂交和免疫组化，免疫印迹基因高表达状态，并在细胞外基质中OPN水平显着较高。温特劳布等[7]证实的OPN的情况下有两种细胞在大鼠血管平滑肌细胞的功能变化：血管平滑肌细胞的胶原蛋白黏附功能缺陷和血管平滑肌细胞凋亡增加，表明OPN的抑制血管平滑肌细胞凋亡。田村等[8] 3O例超过3个月的陈旧性心肌梗死，心导管主动脉和冠状静脉窦的血液样本的OPN浓度测量，分析心肌公布进入冠脉循环的OPN浓度明显比主动脉，左心室造影测量左室射血分数（LVEF）密切相关，OPN的浓度越高，LVEF降低。
3.2整合在心肌重建中的作用
细胞生长和伤口愈合粘连的重要方面之一。生长因子，如血管紧张素Ⅱ能促进大鼠心肌间质成纤维细胞ανβ3和β5mRNA水平增加，但心肌间质成纤维细胞的影响较小。 ανβ3与一个含RGD的各种图案，如FN，FG，COL，和血小板反应蛋白（凝血酶敏感蛋白，TSP）和另一端的单位，并βL和ανβ5配体与Col和VN结束单位的主要区别。被激活在大鼠心肌间质成纤维细胞ανβ3和β1FN和Col一个MAPK的活性增加，同时也为血管紧张素Ⅱ的作用和MAPK活性增加后的直接结果增加表达的原癌基因具有协同作用[9]。如此。 ECM蛋白和生长因子，如血管紧张素Ⅱ对心肌间质激光纤维细胞的联合行动在活细胞中的信号传导途径，并进一步促进薄易碎的增长，这表明，在心肌重建的过程中，ECM起着非常积极的作用。
3.3结果
在正常情况下，在心脏OPN表达水平低，但在许多病理条件下，如急性心肌梗死，慢性压力超负荷，心肌细胞在小鼠左心室肥厚和重塑中发挥重要作用的增强表达的OPN，[10 ，11]。
肺动脉高压和右心室肥厚，其机制是非常复杂。有可能在这一病理过程涉及很多因素的研究。心肌损伤可能会导致显着的心脏重塑，如心肌肥厚，[12]。整合素细胞外基质蛋白相互作用考虑在心脏细胞的生长和心肌肥厚中起着重要作用[13]。骨桥蛋白是一种非胶原的细胞外基质，它包含与心肌细胞表面结合的RGD整合素β3结构，许多研究已经证实在其参与血管平滑肌心肌细胞迁移，增殖和分化过程[14]。
这项研究表明，肺动脉高压，右心室大鼠OPN和整合素β3基因和蛋白表达增加。相关分析表明，骨桥蛋白和整合β3mRNA表达和右心室肥厚大鼠表现出显着的正相关关系，所以我们推测，肺动脉高压，增加右心室压力负荷过重，可能会导致右心室肥大和心肌细胞中高表达与整合素β3和OPN受体。然而，OPN的促进细胞增殖，和下游的信号转导通路仍然是那么进一步研究。

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